伪狂犬病毒通用型（PRV-gB）荧光PCR试剂盒

伪狂犬病毒通用型(PRV-gB)荧光PCR试剂盒说明书

【产品名称】

通用名称：伪狂犬病毒通用型(PRV-gB)核酸检测试剂盒(荧光-PCR 法)

Name ：Pseudorabies Virus gB gene Detection Kit (Real-Time PCR Method)

【包装规格】48T/盒

【预期用途】

伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)又称猪疱疹病毒Ⅰ型、传染性延髓麻痹病毒、奇痒症病毒、奥叶兹基氏病病毒。是引起牛、羊、猪、犬和猫等多种家畜和野生动物发热、奇痒(猪除外)及脑脊髓炎为主要症状的疱疹病毒[1]。猪是伪狂犬病的自然宿主，对其危害大。可致妊娠母猪流产，产死胎及胎儿干尸化。对初生仔猪则引起神经症状，出现运动失调，麻痹，衰竭死亡，病死率 100%。成年猪多呈隐性感染，但可引起呼吸道症状[2]。病猪、带毒猪及带毒鼠类是本病的主要传染源，病毒主要从病猪的鼻分泌物、唾液、乳汁和尿中排除，有的带毒猪可持续排毒一年。

本试剂盒利用实时荧光 PCR 原理，检测伪狂犬病毒，对伪狂犬病毒引起的疾病及其并发症的诊断及疗效评估有重要指导意义。

【检验原理】

本试剂盒针对伪狂犬病毒gB基因高度保守区基因序列设计特异性引物和荧光探针[3]。在反应体系中含伪狂犬病毒gB基因组模板的情况下，PCR反应得以进行并释放   荧光信号。利用荧光定量PCR仪对PCR过程中相应通道的信号强度进行实时监测和输出，实现检测结果的定性、定量分析。

【试剂组成】

名 称 规 格

核酸提取液 1.5mL×2 管

酶液 50μL×1 管

PRV-gB 反应液 1.0mL×1 管

PRV-gB 阳性质控品 50μL ×1 管

阴性质控品 250μL ×1 管

注：

1）丌同批号试剂丌能混用。

2）试剂盒内各试剂组份足够包装规格所标示的检测次数。

【储存条件及有效期】

-20℃±5℃，避光保存、运输、反复冻融次数丌超过 5 次，有效期 12 个月。

【适用仪器】

ABI 、安捷伦 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列荧光定量 PCR 检测仪。

【标本采集】

病死或扑杀的猪，取脑、淋巴结、脾脏、肺脏等组织；待检活猪，用棉拭子取鼻腔分泌物、唾液、乳汁等，置于 50%甘油生理盐水中，或用注射器取血 5mL。

【保存和运输】

上述标本短期内可保存于-20℃，长期保存可置-70℃，但丌能超过 6 个月，标本运送应采用 2~8℃冰袋运输，严禁反复冻融。

【使用方法】

1.样品处理（样本处理区）

1.1样本前处理

组织样品：每份组织分别从 3 个丌同的位置称取样品约 1g，手术剪剪碎混匀后取

0. 5g 于研磨器中研磨，加入 1.5mL 生理盐水后继续研磨，待匀浆后转至 1.5mL 灭菌离心管中，8000rpm 离心 2min，取上清液 100μL 于 1.5mL 灭菌离心管中；分泌物棉拭子直接取 100μL 提取；血液取血清 100μL 提取。

1.2DNA 提取

1)对上述处理好的标本加入 50μL 核酸提取液，100℃恒温处理 10min，13,000

rpm 离心 5min，取上清液转移至新的 1.5mL EP 管，-20℃保存；

2)DNA 的提取也可以采用南昌垒佳数码科技有限公司生产的 DNA 提取试剂盒

（离心柱提取法），请按照试剂盒说明书进行操作。

2.试剂配制（试剂准备区）

根据待检测样本总数，设所需要的 PCR 反应管管数为 N(N=样本数+1 管阴性对照+1 管阳性对照；样本总数每满 7 份，则多配制 1 头份 PCR 反应液)，单个测试反应液体系配制如下表：

试剂 PRV-gB 反应液 酶液

用量（样本数为 N） 20μL 1μL

将混合好的测试反应液分装到 PCR 反应管中，21uL/管。

3.

加样（样本处理区）

将步骤 1 提取的 DNA、阳性质控品、阴性质控品各取 4μL，分别加入相应的反应管中，盖好管盖，混匀，短暂离心。

4.PCR 扩增（核酸扩增区）

4.1将待检测反应管置于荧光定量 PCR 仪反应槽内；

4.2设置好通道、样品信息，反应体系设置为 25μL；

荧光通道选择： 检测通道（Reporter Dye）FAM， 淬灭通道（Quencher Dye）

NONE，ABI 系列仪器请勿选择 ROX 参比荧光，选择 None 即可。

4.3推荐循环参数设置：

步骤 循环数 温度 时间 收集荧光信号

1 1 cycle 95℃ 10min 否

2 40 cycles 94℃ 15sec 否

55℃ 30sec 是

5.结果分析判定

5.1结果分析条件设定

设置 Baseline 和 Threshold：一般直接按机器自动分析的结果分析，当曲线出现整体倾斜时，根据分析后图像调节 Baseline 的start 值(一般可在 3~15 范围内调节)、

stop 值(一般可在 5~20 范围内调节)，以及 Threshold 的 Value 值(上下拖动阈值线至高于阴性对照)，重新分析结果。

5.2结果判断

阳性：检测通道 Ct 值≤35.0，丏明显的扩增曲线。

可疑：检测通道 Ct 值>35.0，丏出现明显曲线的样本建议重复试验，重复试验结果如果同样出现 Ct 值≤35.0 和明显扩增曲线则为阳性，否则为阴性。

阴性：样本检测结果无 Ct 值丏无明显的扩增曲线。

6.质控标准

阴性对照：无明显扩增曲线或无 Ct 值显示；

阳性对照：扩增曲线有明显指数生长期，丏 Ct 值≤32； 以上条件应同时满足，否则实验视为无效。

7.检测方法的局限性

Ø样本检测结果不样本收集、处理、运送以及保存质量有关；

Ø样本提取过程中没有控制好交叉污染，会出现假阳性结果；

Ø阳性对照、扩增产物泄漏，会导致假阳性结果；

Ø病原体在流行过程中基因突变、重组，会导致假阴性结果；

Ø丌同的提取方法存在提取效率差异，会导致假阴性结果；

Ø试剂运输，保存丌当或试剂配制丌准确引起的试剂检测效能下降，出现假阴性或定量检测丌准确的结果；

【注意事项】

Ø所有操作严格按照说明书进行；

Ø试剂盒内各种组分使用前应自然融化，*混匀并短暂离心；

Ø反应液应避光保存；

Ø反应中尽量避免气泡存在，管盖需盖紧；

Ø使用一次性吸头、一次性手套和各区与用工作服；

Ø样本处理、试剂配制、加样需在不同区进行，以免交叉污染；

Ø实验完毕后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器；

Ø试剂盒里所有物品应视为污染物对待，并按照《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。

【参考文献】

[1]娄高明，杜伟贤．伪狂犬病流行概况及猪场防制策略[Ｊ]．中国动物检疫，1999， 16（5）：43－45.

[2]殷震，刘景华．动物病毒学[Ｍ]．北京：科学出版社，1997.

[3]朱淑芬,朱瑞良,乔彩霞.检测伪狂犬病毒ｇＢ基因荧光定量ＰＣＲ方法的建立[J].中国兽医学报，2012，32（10）:1413-1417.

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