艰难梭菌（CD）荧光PCR核酸扩增检测试剂盒

艰难梭菌(CD)荧光PCR核酸扩增检测试剂盒说明书

【产品名称】

通用名称：艰难梭菌 (CD)核酸扩增检测试剂盒(PCR 荧光探针法)

Name ：Diagnostic Kit for Clostridium difficile DNA（PCR Fluorescence Probing）

【包装规格】48T/盒

【预期用途】

本试剂盒适用于检测水样粪便等样本中的艰难梭菌，用于艰难梭菌感染的辅助诊断，其检测结果仅供参考。

【检验原理】

本试剂盒采用 TaqMan 探针法实时荧光 PCR 技术，设计一对艰难梭菌特异性引物，结合一条特异性探针，用荧光PCR 技术对艰难梭菌的核酸进行体外扩增检测， 用于临床上对可疑感染者的病原学诊断。

【试剂组成】

说明：不同批号的试剂盒组分不可交互使用。

【储存条件及有效期】

-20℃±5℃，避光保存、运输、反复冻融少于 7 次，有效期 12 个月。

【适用仪器】

ABI 、安捷伦 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、eppendorf 等系列荧光定量 PCR 检测仪。

【标本采集】

取水样便 0.5~1mL

【保存和运输】

上述标本短期内可保存于-20℃，长期保存可置-70℃，但不能超过 6 个月，标本运送应采用 2~8℃冰袋运输，严禁反复冻融。

【使用方法】

1. 样品处理（样本处理区）

1.1 样本前处理

13000rpm 离心 2min，去尽上清

1.2 DNA 提取

1) 对上述处理好的标本加入等体积核酸提取液（固体标本加入50μL核酸提取液）， 100℃恒温处理 10min，13,000 rpm 离心 5min，取上清液转移至新的 1.5mL EP 管，-20℃保存；

2) DNA 的提取也可以采用南昌垒佳数码科技有限公司生产的DNA提取试剂盒（离心柱提取法），请严格按照试剂盒说明书进行操作。

2. 试剂配制（试剂准备区）

根据待检测样本总数，设所需要的PCR 反应管管数为N(N=样本数+1 管阴性对照+1 管阳性对照；样品每满 7 份，多配制 1 份)，每测试反应体系配制如下表：

3. 加样（样本处理区）

将步骤 1 提取的 DNA、阳性质控品、阴性质控品各取 4μL，分别加入相应的反应管中，盖好管盖，混匀，短暂离心。

4. PCR 扩增（核酸扩增区）

4.1 将待检测反应管置于荧光定量 PCR 仪反应槽内；

4.2 设置好通道、样品信息，反应体系设置为 25μL；

荧光通道选择： 检测通道（Reporter Dye）FAM， 淬灭通道（Quencher Dye）NONE，请勿选择 ROX 参比荧光。

5. 结果分析判定

5.1 结果分析条件设定

设置 Baseline 和 Threshold：一般直接按机器自动分析的结果分析，当曲线出现整体

倾斜时，根据分析后图像调节Baseline 的 start 值(一般可在 3~15 范围内调节)、stop

值(一般可在 5~20 范围内调节)，以及 Threshold 的 Value 值(上下拖动阈值线至高于阴性对照)，重新分析结果。

5.2 结果判断

阳性：检测通道 Ct 值≤35.0，且曲线有明显的指数增长曲线。

可疑：检测通道 Ct 值>35.0，且出现典型扩增曲线的样本建议重复试验，重复试验

结果出现 Ct 值≤35.0 和典型扩增曲线者为阳性，否则为阴性。

阴性：样本检测结果无 Ct 值且无明显的扩增曲线。

6. 检测方法的局限性

1）样本检测结果与样本收集、处理、运送以及保存质量有关；

2）样本提取过程中没有控制好交叉污染，会出现假阳性结果；

3）阳性对照、扩增产物泄漏，会导致假阳性结果；

4）病原体在流行过程中基因突变、重组，会导致假阴性结果；

5）不同的提取方法存在提取效率差异，会导致假阴性结果；

6）试剂运输，保存不当或试剂配制不准确引起的试剂检测效能下降，出现假阴性或定量检测不准确的结果；

7）本检测结果仅供参考，如须确诊请结合临床症状以及其他检测手段。

7. 质控标准

阴性质控品：无明显扩增曲线或无 Ct 值显示；

阳性质控品：扩增曲线有明显指数生长期，且 Ct 值≤32； 以

上条件应同时满足，否则实验视为无效。

8. 产品性能指标

阴阳性参考品符合率：5 份阳性参考品符合率为 100％；10 份阴性参考品符合率为

100％。

低检测限：1.0×10 3copies/mL。

精密度：批内、批间精密度检测 Ct 值的变异系数（CV）均小于等于 3%。

【注意事项】

1）所有操作严格按照说明书进行；

2）试剂盒内各种组分使用前应自然融化，*混匀并短暂离心；

3）反应液应避光保存；

4）反应中尽量避免气泡存在，管盖需盖紧；

5）使用一次性吸头、一次性手套和各区工作服；

6）样本处理、试剂配制、加样需在不同区进行，以免交叉污染；

7）实验完毕后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器；

8）试剂盒里所有物品应视为污染物对待，并按照《微生物生物医学实验室生物安全 通则》进行处理。

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